表达红色荧光及转胸腺素β4基因绵羊胎儿成纤维细胞系的制备

旨在构建胸腺素β4(thymosin beta4,Tβ4)基因真核表达载体并转染绵羊胎儿成纤维细胞,获得稳定表达胸腺素β4及红色荧光蛋白的转基因细胞克隆。将克隆载体pMD19TT中的胸腺素β4基因亚克隆到表达载体pIRES2-DsRed2的多克隆位点,构建表达载体pIRES2-DsRed2-Tβ4,脂质体介导转染绵羊胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。RT-PCR检测Tβ4基因在宿主细胞中的转录。测序结果显示,构建的表达载体pIRES2-DsRed2-Tβ4序列中,Tβ4基因正确连接在CMV启动子下游,顺序连接IRES2序列和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。脂质体介导的稳定转染效率约为15%,经G418筛选得到转基因细胞克隆并高效表达红色荧光蛋白。RT-PCR检测显示外源Tβ4基因在绵羊胎儿成纤维细胞中得到转录。成功构建具有红色荧光蛋白和新霉素抗性双选择标记的胸腺素β4基因真核表达载体并稳定转染绵羊胎儿成纤维细胞,筛选得到的超表达胸腺素β4绵羊胎儿成纤维细胞系为下一步通过核移植和克隆技术获得转基因绵羊提供了条件。     

抗CD20抗体高产细胞株的筛选及质量评估

目的:筛选高表达单克隆细胞株,并通过优化培养基及流加物,最终达到提高目的蛋白产量及质量的目的。方法:通过有限稀释法对转染目的蛋白的CHO-S细胞进行单克隆化,应用双抗夹心ELISA方法对单克隆细胞株抗体表达量进行初步评估,最后根据筛选细胞株的活率、密度、产量及代谢情况,选择2~3株单克隆细胞进行培养条件优化,并对获得的发酵液进行纯化捕获,根据抗体蛋白表达量、糖型、等电点、纯度、酸碱峰分布等进行相应的评估分析,筛选出最优细胞株及最优培养方案。结果:经过单克隆化处理以及培养条件优化,蛋白的表达量由初始的不到500mg/L提升到2 290mg/L,且抗体蛋白纯度高达97.48%。抗体蛋白质量分析结果显示B1方案为该实验最优培养方案。结论:通过细胞株筛选、培养基优化能显著提高抗体蛋白的产量及质量,同时对抗体蛋白糖型、等电点、纯度等均有一定程度的优化。因此工业生产中可以通过高表达克隆的筛选、培养工艺优化等对目的蛋白产量及质量进行一定程度的改善与提高,对后期实验研究及工业化方案开发都具有很好的指导意义。     

基于电容测定的罗汉果细胞超低温保藏快速方法

建立了一种基于活细胞电容值定量测定的植物细胞超低温保藏的快速评价方法,优化了罗汉果细胞超低温保藏方法。通过采用活细胞传感仪测定冻存后细胞的存活率并结合细胞生活力(细胞线粒体活性/TTC)对罗汉果细胞的低温保藏过程进行优化,确定了罗汉果细胞较为适宜的冷冻保护剂组分为基本培养基中添加10%的蔗糖和10%的DMSO。预处理剂的考察实验表明,采用0.2 mol/L蔗糖的预处理剂处理细胞时冻存后细胞存活率和细胞活力较高;采用0.2 mol/L蔗糖预处理剂处理细胞时,随着预处理时间的增加,细胞存活率先增加后降低,预处理时间为9 h时,细胞存活率和细胞活力最高。保藏后的细胞复苏实验结果表明:细胞存活率与采用活细胞电容值得到的细胞存活率具有很好的一致性,同时经过冻存的细胞复苏培养后,仍保留了原始细胞的形态和合成甜苷V的特性,说明该冻存方法适用于罗汉果细胞的超低温保藏。因此基于活细胞传感仪测得的电容值进行细胞冻存过程细胞活性的快速评价方法具有较好的可行性和可靠性。     

库布齐沙漠不同人工固沙灌木林土壤微生物量与土壤养分特征

在库布齐沙漠东段选取人工油蒿+杨柴半灌木混交林、人工柠条锦鸡儿灌木林和人工沙柳灌木林3种人工固沙灌木林为对象,以流动沙地为对照,研究了不同人工固沙灌木林土壤微生物生物量碳和氮、土壤微生物数量、土壤养分变化特征及其相互间的关系,并运用综合指数法对不同人工固沙灌木林的土壤恢复效果进行评价.结果表明: 与流动沙地相比,3种人工固沙灌木林土壤有机质、全氮、全磷、速效氮、速效磷含量均有不同程度的提高,表现为油蒿+杨柴林地＞柠条锦鸡儿林地＞沙柳林地,且均随土层加深而依次降低;3种人工固沙灌木林土壤微生物数量、微生物生物量碳和氮均较流动沙地有不同程度的提高,油蒿+杨柴林地土壤微生物生物量碳氮和细菌相对数量高于柠条锦鸡儿林地和沙柳林地,而真菌与放线菌相对数量则表现为柠条锦鸡儿林地＞沙柳林地＞油蒿+杨柴林地;影响3种人工固沙灌木林土壤细菌相对数量、微生物生物量碳和氮的因素是土壤有机质、全氮、全磷、速效氮、速效磷含量及C/N,而放线菌、真菌相对数量主要受土壤全磷、速效氮和速效磷含量的影响;不同人工固沙灌木林土壤质量排序为:油蒿+杨柴林地＞柠条锦鸡儿林地＞沙柳林地＞流动沙地,表明不同人工固沙灌木林的建植均能提高沙漠土壤质量,其中营造油蒿+杨柴半灌木混交林对提高土壤综合质量效果最好.     

海南岛次生低地雨林棕榈藤伴生群落优势种生态位研究

以海南岛甘什岭自然保护区次生低地雨林群落优势种及棕榈藤为试验材料,通过重要值筛选群落优势种,利用生态位宽度、相似性比例和生态位重叠探究棕榈藤与各林层优势种对资源的作用机制,为棕榈藤资源保护和利用提供理论参考。结果显示:(1)青梅(Vatica mangachapoi)和铁凌(Hopea reticulata)为群落建群种,5种棕榈藤在整个群落中具有相对较高的重要值,但差异较大,其中杖藤(Calamus rhabdocladus)最大(0.286),小钩叶藤(Plectocomia microstachys)最小(0.053),其排序为:杖藤大白藤(C.faberii)黄藤(Daemonorops jenkinsiana)白藤(C.tetradactylus)小钩叶藤。(2)5种棕榈藤在群落中具有较大的生态位宽度,其中杖藤最大(Bi和Ba分别为2.900和0.612),且明显大于草本层,但与其他林层优势种差异小。(3)棕榈藤种间与优势种均表现出较低的生态位相似性比例,除黄藤与亮叶鸡血藤(Callerya nitida)外,各林层优势种与所有棕榈藤种相似性比例最高的物种相同,为益智(Alpinia oxyphylla)、百足藤(Pothos repens)、铁凌和青梅;藤种间,杖藤与各其它棕榈藤具有较高的生态位相似性比例,小钩叶藤最小。(4)林层优势种和棕榈藤的Lik和Lki值总体较低,均低于0.1,且生态位宽度大的不一定重叠程度越高;其中0~0.023的重叠数量占总数的63.5%,0.023~0.046为36.0%,0.046的仅占0.5%。研究认为,棕榈藤在群落中具有相对较高的资源利用能力,但种间差异较大,棕榈藤种间及其与优势种间均表现为生态位分化,物种间倾向于资源共享。     

利用BglBrick方法进行HSA/Exendin-4长效融合蛋白的快速组装

目的：通过合成生物学的BglBrick方法快速构建不同种类HSA/ Exendin-4长效融合蛋白,为进行各HSA/Exendin-4融合蛋白生物学活性的筛选比较奠定基础。方法：选用酵母表达载体pPICZαA质粒,构建pPICZαA-E4和pPICZαA-HSA两种基础Brick表达载体,运用BglBrick方法,实现了不同数目Exendin-4分子在HSA的不同末端的快速组装。将构建出的10种HSA/Exendin-4融合蛋白,转入毕赤酵母菌KM71H中,用甲醇诱导目的蛋白的表达。结果：用BglBrick方法构建的HSA/Exendin-4融合蛋白在毕赤酵母中都成功诱导表达出相应的目的蛋白。结论：利用BglBrick方法能够实现HSA长效融合蛋白的快速组装。     

尖角突脐孢菌与化学除草剂混用防治稻田稗草效果的研究

用平板表面萌发法测定化学除草剂对尖角突脐孢菌菌株X27分生孢子萌发的影响,在温室研究该菌分生孢子干粉与化学除草剂的相互作用,在田间评价其混剂的除稗效果.结果表明,二氯喹啉酸和苄嘧磺隆对分生孢子的萌发影响不明显,其它除草剂均有不同程度的影响.在温室条件下,菌X27干粉与二氯喹啉酸混用具有明显的增效作用,与敌稗混用具有加成作用;在水田条件下,单用菌X27干粉防除稗草效果差,防效只有60%,而与低量的二氯喹啉酸混用,防效明显提高,达90%以上.     

大豆细胞质雄性不育恢复基因GmRf1的精细定位

目前大豆杂交育种主要依赖于以细胞质雄性不育(CMS,cytoplasmic male sterility)为基础的"三系"法,这其中恢复系的选育至关重要.恢复基因的有无和恢复能力的强弱主要通过被测恢复系与不育系测交后代F1的育性确定,既耗时又费力.若能定位和克隆恢复基因(Rf,restorer-of-fertility...     

DC-CIK对K562/A多药耐药基因mdr1 表达的影响

目的：体外观察树突状细胞（dendritic cell，DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine inducedkiller，CIK）对K562/A细胞株 多药耐药基因mdr1 表达的影响。方法：采集健康人的外周血，分离出单个核细胞( peripheral blood mononuclear cell，PBMC )，在 体外加入多种细胞因子经诱导生成DC及CIK 细胞，以流式细胞仪检测其表面标志，将DC 细胞内加入K562/A 细胞裂解物致敏 后，再与CIK细胞混合培养48 小时。将致敏后的DC-CIK 细胞与K562/A及K562 分组培养后以荧光定量PCR 检测其mdr1 基 因表达的情况，PBMC 作为对照组。结果：RT-PCR 中可见K562/A+DC-CIK 组中mdr1 mRNA 表达较K562/A明显降低，经荧光定 量PCR 观察到K562/A 内mdr1 mRNA 表达为K562 的10.27 倍、K562/A/PBMC 略低于未处理的K562/A（P>0.05）， K562/A/DC-CIK 细胞中mdr1 mRNA含量较K562/A、K562/A/PBMC 少（P<0.05）。DC-CIK细胞与细胞株混合培养后，mdr1 基因 表达较混合培养前明显降低。结论：实验数据显示DC-CIK 可使耐药细胞株内mdr1 基因表达下调。但K562 与DC-CIK 混合培养 后该基因降低不明显，提示该基因在细胞中存在着基础表达，意义在于维持细胞内稳态。目前针对逆转白血病耐药的研究较少， 需要多进行相关研究以拓宽细胞免疫治疗在逆转耐药领域的应用。DC-CIK 是具有发展潜力的抗肿瘤方法。本实验将为下一阶段 研究逆转耐药的机制提供依据，DC-CIK 细胞免疫疗法有望成为逆转肿瘤耐药的新方法。